摘要：环二腺苷酸(c-di-AMP)是细菌中广泛存在的第二信号分子。c-di-AMP在细菌中的代谢受二腺苷酸环化酶(DAC)和磷酸二酯酶(PDE)的精密调控。c-di-AMP不仅调节细菌生长、细胞壁稳态、离子转运多种生理过程，而且能够被真核宿主胞内多种感应子/受体蛋白识别，从而调控抗感染免疫。细菌c-di-AMP参与调控宿主I型干扰素应答、NF-κB信号通路活性、自噬以及炎症小体应答等固有免疫应答。此外，c-di-AMP作为黏膜佐剂可诱导宿主适应性免疫。c-di-AMP被认为是一种新发现的病原体相关的分子模式(PAMP)，已成为细菌疫苗和药物研究中的新靶点。

　　关键词：环二腺苷酸;细菌;感染;免疫;固有免疫

　　细菌通过第二信号分子感知细胞表面的信号并激活胞内靶标分子，将原始信号放大从而激活胞内一系列特异性基因的表达，最终影响细菌多种生理生化过程。环二腺苷酸(Cyclic diadenosine monophosphate，c-di-AMP)是2008年发现的一种细菌第二信号分子。目前已在多种细菌中发现了c-di-AMP的存在，它不仅调节细菌生长代谢等多种生理学过程，而且能够被宿主识别并诱导免疫应答。因此，c-di-AMP成为细菌性感染药物和疫苗研究的新靶点。本文主要对c-di-AMP的生理功能及在宿主抗感染免疫中的作用进行综述。

　　1、c-di-AMP概述

　　2008年，Witte等在解析枯草芽胞杆菌DNA完整性扫描蛋白A(DNA integrity scanning protein A，DisA)晶体结构时发现了c-di-AMP分子，因此将DisA命名为二腺苷酸环化酶(Diadenylate cyclase，DAC)，并将其具有催化活性的结构域命名为Dac结构域[1]。c-di-AMP是由两分子ATP经二腺苷酸环化酶A(DacA)催化合成的环状核苷酸分子。枯草芽胞杆菌的DisA是第一个被发现的c-di-AMP合成酶[1]。枯草芽胞杆菌中的二鸟苷酸环化酶(Diguanylate cyclase)YybT可降解细菌环状核苷酸信号分子环二鸟苷酸(Cyclic dimeric guanosine monophosphate，c-di-GMP)。YybT含有GGDEF结构域，可催化GTP合成c-di-GMP，将YybT与其他菌属中含有GGDEF结构域的蛋白命名为GGDEF结构域蛋白(GGDEF domain protein containing PDE，GdpP)[2]。随后发现，YybT含有的DHH/DHHA1结构域具有磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)活性，可水解c-di-AMP为pApA，是c-di-AMP的水解酶。本课题组成员发现结核分枝杆菌中的Rv2837c仅含有DHH/DHHA1结构域，可将c-di-AMP降解为AMP，并将其命名为CnpB(Cyclic nucleotide phosphodiesterase，CnpB)[3]。随后课题组成员发现肺炎链球菌中存在2种含有DHH/DHHA1结构域的PDE酶：Pde1将c-di-AMP降解为pApA，Pde2可将c-di-AMP和pApA降解为AMP[4]。

　　2、c-di-AMP调控宿主固有免疫应答

　　固有免疫是机体抵御微生物尤其是胞内菌感染的重要防线。哺乳动物细胞通过模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)识别微生物的病原体相关的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，启动固有免疫反应[23]。一些致病菌产生的c-di-AMP可被宿主细胞识别并启动下游免疫反应，被认为是固有免疫中新发现的PAMP[12]。细菌感染宿主后c-di-AMP可能同时被真核细胞中多个感应子/受体识别，从而网络式精确调控机体抗感染状态。迄今为止，在真核细胞中发现4个c-di-AMP感应子/受体(Sensor/receptor)或接头蛋白(adaptor)：干扰素基因刺激分子(Stimulator of interferon genes，STING)[24]、一种RNA解旋酶DDX41(D-E-A-D[aspartate-glutamate-alanine-aspartate]-box polypeptide 41，DDX41)[25]、NF-κB控制还原酶(Reductase controlling NF-kB，RECON)[26]以及内质网膜接头蛋白(Endoplasmic reticulum[ER]membrane adaptor，ERAdP)[27]。细菌感染后，c-di-AMP被宿主的感应子/受体识别，从而网络式调控宿主免疫状态，进而影响细菌在宿主体内的生长及传播。因此，c-di-AMP与宿主免疫的相互作用的研究有利于细菌性疾病新疫苗的研制。

　　注：病原菌感染后，细菌自身释放的或细菌被机体杀伤后“泄露”的c-di-AMP和DNA参与调节宿主固有免疫应答.病原菌被巨噬细胞吞噬后，细菌DNA通过cGAS或者DDX41介导STING依赖的I型干扰素应答，c-di-AMP也可通过DDX41和STING激活宿主IFN-β应答.c-di-AMP通过激活ERAdP或者解除RECON对NF-κB的抑制效应从而激活NF-κB通路活性.c-di-AMP可诱导NLRP3依赖的炎症小体应答.此外，c-di-AMP也可激活宿主细胞自噬.Note:After the bacteria infect the host,c-di-AMP and DNA that are released by the bacteria themselves or killed by host are involved in regulating the host innate immune response.After phagocytosis by macrophage,bacterial DNA mediates STING-dependent type I interferon responses via cGAS or DDX41,and c-di-AMP also induces IFN-βresponses via DDX41 and STING.C-di-AMP activates NF-κB pathway by activating ERAdP or inhibiting RECON.C-di-AMP induces NLRP3-dependent inflammasome response.In addition,c-di-AMP activates host cell autophagy.

　　2.1 c-di-AMP激活I型干扰素应答

　　胞质监督途径(Cytosolic surveillance pathway，CSP)是机体抵抗病毒、细菌感染的重要免疫防御机制。细菌感染宿主后，其DNA被宿主DNA感受器环鸟-腺苷酸合酶(Cyclic-GMP-AMP synthase，cGAS)识别，活化的cGAS合成环鸟-腺苷酸(Cyclic-GMP-AMP，cGAMP)并将感染信号传递至STING，接头分子STING募集TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)并激活干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)，诱导I型干扰素产生[28]。STING是调控I型干扰素表达的关键分子之一，在机体抵抗病毒及细菌感染中发挥重要作用。多个研究证明STING是c-di-GMP的直接受体分子[29,30,31]。c-di-GMP与DDX41也存在直接相互作用，而DDX41相比于STING对c-di-GMP具有更高的亲和力，同时c-di-AMP也可与DDX41结合[25]。STING不仅参与细菌DNA诱导的固有免疫，还可识别细菌特有的环状核苷酸分子c-di-AMP和c-di-GMP从而调控抗感染免疫[28]。

　　2010年，Woodward等[9]首次报道c-di-AMP能够直接激活宿主IFN-β应答。敲除李斯特菌c-di-AMP分解酶突变株感染巨噬细胞后IFN-β表达显着上调，而c-di-AMP合成酶的条件性去除(Conditional depletion)株感染巨噬细胞后也可诱导IFN-β应答[11]。本课题组成员前期首次报道，结核分枝杆菌Rv3586是与DisA同源的c-di-AMP合成酶[32]，随后采用c-di-AMP分解酶敲除的结核分枝杆菌感染巨噬细胞，发现IFN-β应答水平升高，而该过程不依赖于NOD2[3]。Dey等发现过表达c-di-AMP合成酶或敲除c-di-AMP分解酶的结核分枝杆菌均可激活IRF，从而诱导宿主IFN-β应答水平上升，且该过程依赖于STING的激活[12]，同时STING蛋白对于c-di-GMP诱导的I型干扰素反应也是必需的[33]。用过表达Rv3586的重组卡介苗感染巨噬细胞，发现IFN-β表达显着增加[34]。上述研究表明，c-di-AMP通过STING通路介导了宿主以Ⅰ型干扰素IFN-β释放为特征的固有免疫应答。

　　此外，c-di-AMP能够显着诱导树突状细胞(Dendritic cell，DC)IFN-β应答，但是当c-di-AMP持续刺激DC时，可引发钙蛋白酶介导的STING蛋白的降解，使得IFN-β分泌减少[35]。提示细菌来源的c-di-AMP虽然可诱导宿主细胞免疫应答，但是这种作用可能是自限性的、不连续的，推测宿主具有相应的调控机制，以避免c-di-AMP诱导过度的免疫应答导致免疫病理损伤。

　　2.2 c-di-AMP促进NF-κB通路活性

　　NF-κB是广泛存在的多功能核转录因子，其调节包括免疫识别受体、细胞因子、抗原提呈蛋白、黏附分子、趋化因子等多种靶基因表达，这些分子在抗感染及炎症反应中发挥重要作用。

　　NF-κB控制还原酶RECON是NF-κB通路抑制子。研究发现，c-di-AMP抑制RECON活性从而促进了炎症细胞因子IFN-β、趋化因子CCL5、CXCL11的表达，限制了李斯特菌、衣原体在宿主免疫细胞及非免疫细胞(肝脏细胞系)内的存活[26]。c-di-AMP通过抑制RECON酶活性增强促炎因子的产生，这种抗感染方式与依赖STING激活的抗感染应答是不同的。然而，李斯特菌感染肝脏细胞后，其分泌的c-di-AMP抑制了RECON活性，增强NF-κB活性及一氧化氮(NO)产生，但NO却促进了细菌在细胞间的传播(Cell-to-cell spread)，这不同于以往的c-di-AMP有助于宿主清除病原菌感染机制，推测不同细菌感染宿主后c-di-AMP作用时间、方式及与宿主细胞相互作用存在差异[36]。

　　最新发现，内质网膜接头蛋白ERAdP缺陷小鼠感染李斯特菌后，促炎细胞因子产生减少，感染小鼠对细菌清除能力降低，小鼠生存率降低，表明ERAdP介导促炎细胞因子产生对于机体控制细菌感染至关重要[27]。c-di-AMP与ERAdP蛋白C端结合，使ERAdP形成二聚体并激活转化生长因子β激活酶1(TGF-βactivated kinase 1，TAK1)，启动下游NF-κB活化，诱导促炎细胞因子TNF-α、IL-6释放增加，促进了机体抗感染免疫[27]。ERAdP-TAK1通路为清除李斯特菌感染所必需。ERAdP是c-di-AMP的直接感应子，而且c-di-AMP与ERAdP亲和力强于STING[27]。

　　2.3 c-di-AMP激活炎症小体

　　NOD样受体(NOD like receptor，NLR)是一类分布于胞浆中的识别病原体的PRR分子，招募多种蛋白质组成炎症小体(Inflammasome)，炎性小体激活后活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)，活化的Caspase-1剪切IL-1β、IL-18使其成熟，并发挥促炎作用[37]。以IL-1β、IL-18产生为特征的炎症小体的激活是宿主防御多种病原体所必需[38]。

　　细菌感染宿主后，适度的炎症应答可促进机体对病原菌清除。NLR家族NLRP1、NLRP3、NLRC4以及HIN200结构域家族的黑素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2，AIM2)炎症小体可识别病原体上的PAMP，产生防御性炎症反应。其中NLRP3主要分布于巨噬细胞、中性粒细胞胞质及胞膜，与病毒和胞内菌感染关系密切，也是NLR家族研究最为深入的成员[37]。研究发现，c-di-AMP和c-di-GMP均可诱导巨噬细胞系THP-1和小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophage，BMDM)Caspase-1的表达增加，并释放高水平的IL-1β；NLRP3?/?小鼠的BMDM对c-di-AMP和c-di-GMP刺激的反应性缺失，表明c-di-AMP和c-di-GMP激活炎症小体应答是NLRP3依赖的，且该过程不依赖于STING分子[39]。课题组前期研究表明c-di-AMP能够诱导巨噬细胞NLRP3、IL-1β转录上调，而且过表达Rv3586的重组卡介苗可促进炎症小体关键分子NLRP3、NLRC4、IL-1β表达上调(待发表数据)。因此，c-di-AMP对炎症小体的激活作用有助于机体抗感染免疫。

　　2.4 c-di-AMP激活宿主细胞自噬

　　自噬(Autophagy)是真核细胞中普遍存在的免疫防御机制。促进自噬有助于宿主对入侵病原菌(如：结核分枝杆菌、沙门氏菌、李斯特菌)的清除。微管相关蛋白质轻链3(LC3)的表达被认为是自噬发生的金标准[40]，而p62蛋白水平与自噬活性负相关[41]。

　　Dey等[12]首次报道，过表达c-di-AMP合成酶的重组结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，自噬小体标志性分子LC3表达显着增加，同时LC3II蛋白水平显着增加，表明c-di-AMP激活了自噬，且自噬的激活抑制了感染细胞内细菌的生长。本课题组成员发现c-di-AMP能够诱导巨噬细胞自噬相关基因LC3、Beclin1、Atg5及Atg7转录水平上调，但是过表达c-di-AMP合成酶的重组卡介苗并不影响LC3蛋白表达水平[37]。自噬是多基因协同完成的精密调控过程，营养匮乏、感染等因素均可诱导自噬发生[42,43]，而自噬信号的缺乏和抑制是胞内菌免疫逃逸的重要原因之一，因此提高c-di-AMP水平促进细胞自噬，有助于机体抵抗病原菌感染[12]。

　　3、c-di-AMP诱导的黏膜免疫应答

　　黏膜免疫系统广泛分布于呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺体处的淋巴组织，是执行局部非特异性免疫功能的主要场所，对呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道等抗感染免疫非常重要。

　　Ebensen等[44]将c-di-AMP作为佐剂，与β-半乳糖苷酶联合滴鼻免疫小鼠，可促进IgA和IgG，及IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4分泌，表明c-di-AMP作为黏膜免疫佐剂可诱导强烈的适应性免疫应答。以c-di-AMP及cGAMP与白蛋白联合免疫小鼠，也可诱导黏膜免疫应答，并且c-di-AMP相比于cGAMP能够诱导更强的体液和细胞免疫应答[45]。对其机制研究表明，c-di-AMP可促进DC成熟相关分子CD80、CD86、MHC-Ⅱ类分子的表达[45]。DC细胞膜上的CD80、CD86是T细胞表面共刺激分子CD28的配体，因此，c-di-AMP可促进T细胞的增殖和活化，进而发挥特异性免疫。课题组研究发现，c-di-AMP与结核分枝杆菌抗原联合经黏膜免疫小鼠，可诱导高水平的黏膜免疫应答，并可抵抗一定数量的结核分枝杆菌感染(待发表数据)。因此，c-di-AMP与亚单位疫苗联合用于黏膜免疫，可能获得免疫效果更好的黏膜免疫疫苗。

　　4结语

　　细菌c-di-AMP激活宿主固有免疫在抗感染中的积极作用备受关注[3,11,12,22,46]。在宿主与细菌的长期作用中，宿主具备了c-di-AMP的识别、感应机制以监控感染。一方面，细菌分泌的c-di-AMP能够激活以I型干扰素释放为特征的固有免疫应答；另一方面，细菌通过控制释放到宿主细胞中c-di-AMP的含量，逃避免疫识别而加剧感染的发生。c-di-AMP可诱导机体I型干扰素应答、炎症因子激活及自噬发生，有助于机体抗感染免疫；但同时，c-di-AMP诱导产生的NO促进细菌的细胞间播散[36]。因此，需要进一步借助多种研究方法进行多层面深入的研究，全面审视c-di-AMP在宿主感染中发挥的作用。本课题组研究表明，c-di-AMP作为免疫佐剂单独使用时免疫效能较低，与抗原联合免疫可显着增强抗原免疫效能，同时通过提高卡介苗内源性c-di-AMP的水平，可显着提高卡介苗诱导的免疫应答水平，这将有助于新型细菌疫苗的设计[34]。此外，鉴于多种细菌采用c-di-AMP为信号分子，若用于疫苗或免疫调节剂，需要进一步研究c-di-AMP对机体正常菌群的可能的调节作用。目前对细菌c-di-AMP的研究仍处于早期阶段，c-di-AMP在宿主固有免疫和适应性免疫中的作用机制仍需进一步深入探究。

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